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提早知道所培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)基中是否有細(xì)菌污染的一種方法

更新時(shí)間:2020-11-17  |  點(diǎn)擊率:983

培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),要避免細(xì)菌污染。如果存在細(xì)菌污染,則培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯,細(xì)胞大多在24小時(shí)死亡。在以細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)為基礎(chǔ)的生物藥產(chǎn)業(yè)中,也需要進(jìn)行無(wú)菌檢查。傳統(tǒng)無(wú)菌檢查是采用TSATSB培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法,一般需要培養(yǎng)14天,觀察是否有菌落生長(zhǎng)或溶液渾濁。

現(xiàn)介紹一種通過(guò)PCR進(jìn)行無(wú)菌檢查的方法,當(dāng)然該方法也是用于研究。即采用德國(guó)MB的細(xì)菌檢測(cè)試劑盒(Onar Bacteria Detection Kit)。它作為PCR試劑盒,針對(duì)的是細(xì)菌高度保守的16S rRNA序列,陽(yáng)性產(chǎn)物片段大小為467 bp,可跑膠后在紫外燈下觀察。另包含一個(gè)內(nèi)控對(duì)照,用于檢測(cè)PCR反應(yīng)是否正常,該內(nèi)控對(duì)照條帶為140 bp。

需要注意的是,樣品在檢測(cè)前,應(yīng)在95 °C做熱滅活 5分鐘,之后每個(gè)PCR反應(yīng)是加5ul。另外,細(xì)胞培養(yǎng)液中應(yīng)不含抗生素,細(xì)胞應(yīng)在不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代,因?yàn)榭股貢?huì)使細(xì)菌水平保持在檢測(cè)限以下(2.4×103次方/ml)。另外,檢測(cè)時(shí)應(yīng)做復(fù)孔。整個(gè)反應(yīng)體系為25ul。

該試劑盒可檢測(cè)的細(xì)菌包括:假單胞菌,放線菌,大腸埃希氏菌,沙雷氏菌,卟啉單胞菌,梭菌,葡萄球菌,鏈球菌,乳桿菌,微球菌,芽孢桿菌,克雷伯菌,沙門氏菌,腸球菌,分枝桿菌,軍團(tuán)菌,葡萄球菌,消化鏈球菌。它不檢測(cè)真菌、病毒和真核細(xì)胞DNA。

典型結(jié)果如下:

 

總之,早期篩查細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是否有細(xì)菌污染,可以及時(shí)采取措施,而PCR方法更為靈敏、快速和穩(wěn)定,可以根據(jù)實(shí)際情況酌情使用。

 . 內(nèi)控對(duì)照顯示PCR反應(yīng)正常,樣本中無(wú)PCR抑制成分。460bp左右存在目的條帶,提示存在細(xì)菌污染。

 

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